第一節(jié)　基因診斷

一、基因診斷常用技術(shù)：

（一）核酸分子雜交技術(shù)：由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測(cè)方法的靈敏性，它已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測(cè)等。核酸分子雜交（簡(jiǎn)稱(chēng)雜交）是核酸研究中一項(xiàng)最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)�；パa(bǔ)的核苷酸序列通過(guò)Walson-Crick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過(guò)程稱(chēng)為雜交。

1、Southern 雜交

2、Northern 雜交

3、原位雜交（ISH）

4、熒光原位雜交（FISH）

5、芯片雜交（屬于固一液相雜交）

每一種雜交技術(shù)都有其特點(diǎn)，因探針的選擇不同又可以衍生出許多相關(guān)的技術(shù)，在不同領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。

（二）DNA測(cè)序：是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥(niǎo)嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA測(cè)序方法的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)現(xiàn)。在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于測(cè)序的技術(shù)主要有雙脫氧鏈末端終止法和化學(xué)降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開(kāi)始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生 A，T，C，G四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得DNA序列。以此為基礎(chǔ)近年來(lái)又發(fā)明了采用自動(dòng)化測(cè)序儀進(jìn)行的自動(dòng)測(cè)序技術(shù)。

（三）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)，是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的新方法。該方法一改傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的模式，不通過(guò)活細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可使幾個(gè)拷貝的模板序列甚至一個(gè)DNA分子擴(kuò)增107～108倍，大大提高了DNA的得率。已廣泛應(yīng)用到分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

（四）連接酶鏈反應(yīng)（LCR)：是在連接酶擴(kuò)增反應(yīng)或連接酶檢測(cè)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引入熱穩(wěn)定的連接酶而建立的類(lèi)似PCR 技術(shù)的新方法。LCR 既可擴(kuò)增，又可鑒定D N A 異常，與PCR 技術(shù)一樣可用于已知病因的遺傳病大面積普查。LCR 即在D N A 連接酶的作用下，通過(guò)連接與模板D N A互補(bǔ)的兩個(gè)相鄰寡核苷酸鏈，快速進(jìn)行D N A 片段擴(kuò)增。D N A連接酶可將與模板D N A 鏈互補(bǔ)的兩條毗鄰寡核苷酸片段連接起來(lái)，兩條寡核苷酸鏈接頭處存在堿基錯(cuò)配則阻止連接反應(yīng)的發(fā)生。所以通過(guò)連接酶反應(yīng)，可明確區(qū)分寡聚核苷酸是否與模板D N A 完全互補(bǔ)，檢測(cè)基因點(diǎn)突變。

（五）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）：是利用DNA或RNA單鏈構(gòu)象具有多態(tài)性的特點(diǎn)，結(jié)合PCR技術(shù)進(jìn)行基因檢測(cè)的一種分析技術(shù)，稱(chēng)為PCR-SSCP技術(shù)，用以分析微生物的遺傳學(xué)特征和基因突變。提高了基因突變檢測(cè)的靈敏性，現(xiàn)已廣泛用于遺傳病及腫瘤基因分析。

（六）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)： 技術(shù)的原理是檢測(cè)DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位點(diǎn)變異的突變?nèi)琰c(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和 一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長(zhǎng)度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。在法醫(yī)學(xué)中已成為常規(guī)手段和方法。

（七）單核苷酸多態(tài)性分析（SNP)：主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類(lèi)基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。因此,SNP成為第三代遺傳標(biāo)志,人體許多表型差異、對(duì)藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。 現(xiàn)在普遍認(rèn)為SNP研究是人類(lèi)基因組計(jì)劃走向應(yīng)用的重要步驟。這主要是因?yàn)镾NP將提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具，用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計(jì)和測(cè)試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究等。SNP在基因組中分布相當(dāng)廣泛，近來(lái)的研究表明在人類(lèi)基因組中每300堿基對(duì)就出現(xiàn)一次。大量存在的SNP位點(diǎn)，使人們有機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)與各種疾病，包括腫瘤相關(guān)的基因組突變；從實(shí)驗(yàn)操作來(lái)看，通過(guò)SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因突變要比通過(guò)家系來(lái)得容易；有些SNP并不直接導(dǎo)致疾病基因的表達(dá)，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標(biāo)記。

（八）基因芯片技術(shù)：（又稱(chēng)DNA芯片、生物芯片），基因芯片的測(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過(guò)確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。然而 , 怎樣去研究如此眾多基因在生命過(guò)程中所擔(dān)負(fù)的功能就成了全世界生命科學(xué)工作者共同的課題。為此，建立新型雜交和測(cè)序方法以對(duì)大量的遺傳信息進(jìn)行高效、快速的檢測(cè)、分析就顯得格外重要了�；�因芯片（又稱(chēng) DNA 芯片、生物芯片）技術(shù)就是順應(yīng)這一科學(xué)發(fā)展要求的產(chǎn)物，它的出現(xiàn)為解決此類(lèi)問(wèn)題提供了光輝的前景。該技術(shù)系指將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于 400 ）探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷虾笈c標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。通俗地說(shuō)，就是通過(guò)微加工技術(shù) ，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)、乃至百萬(wàn)計(jì)的特定序列的DNA片段（基因探針），有規(guī)律地排列固定于2cm2的硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個(gè)二維DNA探針陣列，與計(jì)算機(jī)的電子芯片十分相似，所以被稱(chēng)為基因芯片�；�因芯片被廣泛應(yīng)用于優(yōu)生、疾病診斷、器官移植、病原體診斷、過(guò)敏性疾病的環(huán)境監(jiān)測(cè)、法醫(yī)學(xué)等方面。

二、基因診斷的臨床應(yīng)用：

1、用于遺傳疾病的基因診斷；

2、用于感染性疾病的基因診斷；

3、用于腫瘤的基因診斷；

4、用于藥物代謝基因診斷；

5、基因診斷在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。