第四節(jié)　性傳播疾病病原體檢測

一、AIDS病原體檢測：目前檢測HIV的方法有100多種，可以分為抗體檢測和病毒檢測兩大類。

（一）病毒檢測：包括細胞培養(yǎng)(病毒分離)、p24抗原檢測和病毒核酸檢測。早期對HIV的診斷主要是通過血清學(xué)試驗檢測抗HIV的抗體,間接地診斷HIV感染。隨著生物科技的發(fā)展，近年來分子生物學(xué)方法不斷被應(yīng)用到HIV的檢測中，尤其核酸檢測已經(jīng)成為了HIV實驗室診斷的發(fā)展方向，它可直接檢查HIVRNA,可在發(fā)現(xiàn)血清學(xué)變化之前檢測HIV感染,而且比P24抗原檢測方法更靈敏。

（二）抗體檢測：HIV抗體一般在人感染后幾周逐漸出現(xiàn),可延續(xù)至終生，血清學(xué)試驗分為初篩和確認試驗。最常用的初篩試驗和確認試驗分別是酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印跡試驗(WB)。常規(guī)實驗方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫印跡試驗、間接免疫熒光法(IFA)�？焖贆z測方法：明膠顆粒凝集試驗、斑點免疫結(jié)合試驗、P24抗原的檢測、分子生物學(xué)方法、RT?PCR檢測法、熒光實時PCR檢測技術(shù)、支鏈DNA(bDNA)、連接酶酶促鏈式反應(yīng)(LCR)、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)。

二、梅毒病原體檢測：

1、暗視野顯微鏡檢：暗視野顯微鏡檢查是一種檢查梅毒螺旋體的方法。暗視野，顧名思義即是顯微鏡下沒有明亮的光線，它便于檢查蒼白的螺旋體。這是一種病原體檢查，對早期梅毒的診斷有十分重要的意義。

早期皮膚粘膜損害（一期、二期霉瘡）可查到蒼白螺旋體。一期梅毒蒼白螺旋體多在硬下疳的硬結(jié)、潰瘍的分泌物和滲出液中存在，腫大的淋巴結(jié)穿刺也可檢出。二期梅毒蒼白螺旋體可在全身血液和組織中檢出，但以皮膚檢出率最高。早期先天性梅毒，可以通過皮膚或粘膜損害處刮片發(fā)現(xiàn)梅毒蒼白螺旋體。最近，通過羊膜穿刺術(shù)獲得孕婦的羊水，以其作暗視野顯微鏡觀察，對先天性梅毒有診斷價值。

2、梅毒血清學(xué)檢測：梅毒血清學(xué)檢查對于診斷二期、三期梅毒，以及判定梅毒的發(fā)展和痊愈，判斷藥物的療效都有十分重要的意義。梅毒血清學(xué)檢查包括非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗和梅毒螺旋體血清學(xué)試驗。前者常用于臨床篩選及判定治療的效果，抽血后1小時即可出結(jié)果，費用也低廉。后者主要是用于判定試驗，但是它不能判定治療效果，一旦患有梅毒，這一試驗將終身陽性。

（1）非梅毒螺旋體血清試驗：　這類試驗的抗原分為心磷脂、卵磷脂和膽固醇的混懸液，用來檢測抗心磷脂抗體。由于這些試驗具有相同的標(biāo)準化抗原，所以敏感性相似。常用的有三種：①性病研究實驗室玻片試驗（VDRL）；②血清不加熱的反應(yīng)素玻片試驗（USR）；③快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗（RPR）。可用作臨床篩選，并可作定量，用于療效觀察。

（2）梅毒螺旋體血清試驗：　包括有：①熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）；②梅毒螺旋體血凝試驗（TPHA）；③梅毒螺旋體制動試驗（TPI）等。這類試驗特異性高，主要用于診斷試驗。

（3）梅毒螺旋體IgM抗體檢測：梅毒螺旋體IgM抗體檢測是近年來才有的新的診斷梅毒的方法。IgM抗體是一種免疫球蛋白，用它來診斷梅毒具有敏感性高，能早期診斷，能判定胎兒是否感染梅毒螺旋體等優(yōu)點。特異性IgM類抗體的產(chǎn)生是感染梅毒和其他細菌或病毒后機體首先出現(xiàn)的體液免疫應(yīng)答，一般在感染的早期呈陽性，隨著疾病發(fā)展而增加，IgG抗體隨后才慢慢上升。經(jīng)有效治療后IgM抗體消失，IgG抗體則持續(xù)存在，TP-IgM陽性的一期梅毒病人經(jīng)過青霉素治療后，約2～4周TP-IgM消失。二期梅毒TP-IgM陽性病人經(jīng)過青霉素治療后，2～8個月之內(nèi)IgM消失。此外，TP-IgM的檢測對診斷新生兒的先天性梅毒意義很大，因為IgM抗體分子較大，其母體IgM抗體不能通過胎盤，如果TP-IgM陽性則表示嬰兒已被感染。

3、基因檢測技術(shù)：特異性強，敏感性高，適用于梅毒孕婦羊水、新生兒血清和腦脊液標(biāo)本檢查，所謂PCR即多聚酶鏈式反應(yīng)，即從選擇的材料擴增選擇的螺旋體DNA序列，從而使經(jīng)選擇的螺旋體DNA拷貝數(shù)量增加，能夠便于用特異性探針來進行檢測，以提高診斷率。但是，這種實驗方法，要求有條件絕對好的實驗室和技術(shù)一流的技師。其實診斷梅毒不一定要作PCR，作一般的抽血化驗即可。

4、腦脊液檢查：晚期梅毒患者，當(dāng)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，經(jīng)過驅(qū)梅治療無效，應(yīng)作腦脊液檢查。這一檢查對神經(jīng)梅毒的診斷、治療及預(yù)后的判斷均有幫助。檢查項目應(yīng)包括：細胞計數(shù)、總蛋白測定、VDRL試驗及膠體金試驗。

三、淋病病原體檢測：

(一)涂片檢查：取患者尿道分泌物或?qū)m頸分泌物，作革蘭氏染色，在多形核白細胞內(nèi)找到革蘭氏陰性雙球菌。涂片對有大量膿性分泌物的單純淋菌性前尿道炎患者，此法陽性率在90%左右，可以初步診斷。女性宮頸分泌物中雜菌多，敏感性和特異性較差，陽性率僅為50-60%，且有假陽性，因此世界衛(wèi)生組織推薦用培養(yǎng)法檢查女病人。慢性淋病由于分泌物中淋球菌較少，陽性率低，因此要取前列腺按摩液，以提高檢出率。咽部涂片發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性雙球菌不能診斷淋病，因為其他奈瑟菌屬在咽部是正常的菌群。另外對癥狀不典型的涂片陽性應(yīng)作進一步檢查。

(二)培養(yǎng)檢查：淋球菌培養(yǎng)是診斷的重要佐證，培養(yǎng)法對癥狀很輕或無癥狀的男性、女性病人都是較敏感的方法，只要培養(yǎng)陽性就可確診，在基因診斷問世以前，培養(yǎng)是世界衛(wèi)生組織推薦的篩選淋病的唯一方法。目前國外推薦選擇培養(yǎng)基有改良的thayer-martin(TM)培養(yǎng)基和new york city(NYC)培養(yǎng)基。國內(nèi)采用巧克力瓊脂或血瓊脂培養(yǎng)基，均含有抗生素，可選擇地抑制許多其他細菌生長。在36℃，70%濕度，含5%-10%co2(燭缸)環(huán)境中培養(yǎng)，24-48小時觀察結(jié)果。培養(yǎng)后還需進行菌落形態(tài)，革蘭氏染色，氧化酶試驗和糖發(fā)酵試驗等鑒定。培養(yǎng)陽性率男性80%-95%，女性80-90%。

(三)抗原檢測：

1、固相酶免疫試驗，用來檢測臨床標(biāo)本中的淋球菌抗原，在流行率很高的地區(qū)而又不能作培養(yǎng)或標(biāo)本需長時間遠送時使用，可以在婦女人群中用來診斷淋球菌感染。

2、直接免疫熒光試驗：通過檢測淋球菌外膜蛋白i的單克隆抗體作直接免疫熒光試驗。但目前在男女二性標(biāo)本的敏感不高，特異性差，加之實驗人員的判斷水平，故該實驗尚不能推薦用來診斷淋球菌感染。

(四)基因診斷：

1、淋球菌的基因探針診斷，淋球菌的基因探針診斷，所用的探針有：質(zhì)粒dna探針，染色體基因探針和rrna基因探針。

2、淋球菌的基因擴增檢測，上面講述的探針技術(shù)檢測淋球菌的方法，雖然比培養(yǎng)方法在靈敏度，特異性和方便性上有了很大的提高，但其仍有一定的局限性，如多數(shù)情況下需要標(biāo)本的淋球菌濃度很高，pcr技術(shù)和連接酶鏈反應(yīng)的出現(xiàn)進一步提高了檢測淋球菌的靈敏性，它具有快速、靈敏、特異、簡便的優(yōu)點，可以直接檢測臨床標(biāo)本中極微量的病原體。

四、非淋菌尿道炎病原體檢測：

1、直接免疫熒光法：將特異的衣原體單克隆抗體用熒光素標(biāo)記后檢測標(biāo)本中的衣原體抗原，如標(biāo)本中有衣原體，則和抗體結(jié)合，在熒光鏡下可見蘋果綠色的熒光，一張涂片中衣原體數(shù)在10個以上時為陽性，特異性＞97%，敏感性為70%～92%。

2、血清學(xué)酶聯(lián)免疫法：用光譜測相儀檢測泌尿生殖道中的衣原體抗原，發(fā)現(xiàn)顏色改變?yōu)殛栃裕?4小時獲得結(jié)果，敏感性為60%～90%，特異性為92%～97%。

3、沙眼衣原體培養(yǎng)：沙眼衣原體為專性細胞內(nèi)寄生物，只有在活細胞中才能生長繁殖，常用于衣原體培養(yǎng)的細胞是McCoy細胞和Hela229細胞，特異性為99%～100%，敏感性為68.4%～100%，是目前診斷沙眼衣原體的金標(biāo)準。

4、解脲支原體培養(yǎng)：利用解脲支原體能分解精氨酸產(chǎn)氨，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸的原理，分別使含精氨酸的肉湯培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，指示劑顏色由黃變紅，葡萄糖肉湯培養(yǎng)基由粉紅色變?yōu)辄S色，該方法已廣泛應(yīng)用于臨床。

5、分子生物學(xué)：利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和連接酶聯(lián)反應(yīng)（LCR），敏感性和特異性均優(yōu)于其他方法，但要注意防止污染造成的假陽性。

五、生殖器皰疹病原體檢測：

（一）細胞學(xué)檢查：挑取泡液或從皰底潰瘍面刮取少量皮損進行涂片，通過Wright-Giemsa染色或Papanicolaou染色，尋找大的多核巨細胞和多核巨細胞核內(nèi)嗜酸包涵體。但此方法不能區(qū)別HSV感染或水痘-帶狀皰疹病毒感染等相關(guān)皰疹病毒類疾病，只有在急性期水皰出現(xiàn)時才可能得出陽性結(jié)果。一般作為初篩試驗。

（二）免疫細胞化學(xué)檢查：通常用皮損細胞涂片，經(jīng)特殊處理后在熒光顯微鏡下觀察檢測抗原，生殖器皰疹病毒感染細胞可見亮綠色熒光。

（三）病毒分離：通常用棉拭子從發(fā)病1-3天內(nèi)的水皰底部取得標(biāo)本，用人胚成纖維細胞、人羊膜細胞、腎細胞等進行病毒分離培養(yǎng)、再通過免疫熒光法鑒定、加以確認。其分離成功的前提是取材的準確和盡快接種，由于其操作復(fù)雜，費用昂貴，技術(shù)條件要求高，目前尚不能普遍使用。

（四）抗體檢測法：HSV抗體檢測不能作為生殖器皰疹診斷的依據(jù)。但情況下，如判斷是否曾經(jīng)感染過HSV；癥狀不典型的感染者；評估生殖器皰疹患者配偶所生新生兒的感染風(fēng)險以及單純皰疹預(yù)防接種時可能得到的成功率。這時應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中HSV-1和HSV-2 IgM/IgG抗體。

(五)基因檢測法：用PCR熒光定量法檢測皮損的HSV-Ⅱ-DNA。能直接檢測出生殖器潰瘍性疾病患者損害部位的HSV-2病原體，敏感性和特異性高，大大提高生殖器潰瘍病人中HSV確診的能力。其費用較昂貴，且操作技術(shù)、實驗室條件和設(shè)備的要求也較高。

六、尖銳濕疣病原體檢測：

（一）醋白試驗：以3%～5%的醋酸溶液浸濕的紗布包繞或敷貼在可疑的皮膚或黏膜表面，3～5分鐘后揭去，典型的尖銳濕疣損害將呈現(xiàn)白色丘疹或疣贅狀物，而亞臨床感染則表現(xiàn)為白色的斑片或斑點。醋白試驗對辨認早期尖銳濕疣損害及亞臨床感染是一個簡單易行的檢查方法。對發(fā)現(xiàn)尚未出現(xiàn)肉眼可見改變的亞臨床感染是一個十分有用的手段。醋白試驗簡單易行，應(yīng)作為尖銳濕疣患者的一個常規(guī)檢查手段，有助于確定病變的范圍，進行指導(dǎo)治療。但醋白試驗并不是個特異性的試驗，對上皮細胞增生或外傷后初愈的上皮可出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。

（二）細胞學(xué)宮頸涂片檢查：主要用于檢查女性陰道或?qū)m頸上皮有否HPV的感染。在被檢部位刮取細胞并涂于玻片上，以95%酒精固定;常用巴氏染色法，鏡下所見分為五級。

（三）分子生物學(xué)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):取病變組織或可疑部位樣品，提取DNA，利用特異引物對目標(biāo)DNA予以擴增。引物可以是HPV通用引物，亦可以是針對某一型的特異引物。該法敏感性高，特異性強，但該方法應(yīng)該在通過相關(guān)機構(gòu)認可或認證的實驗室進行開展。

（四）免疫組化檢查：用帶有過氧化物的抗體檢查HPV抗原，對病原體進行組織定位，有PAP法和ABC法。

七、軟下疳病原體檢測：

（一）抗體檢測法：在目前，抗體檢測應(yīng)用最廣泛的是HSV-2抗體檢測，如蛋白印跡法也可用GD2作抗原檢測HSV-2抗體，具有敏感性，且能區(qū)分HSV-1和HSV-2的優(yōu)點。

（二）血清學(xué)檢查：一般情況下，血清學(xué)檢查主要用于檢測抗HSV-1和抗HSV-2抗體，診斷HSV的原發(fā)性感染，進行HSV感染的血清流行病學(xué)調(diào)查�？刹捎妹庖邿晒庠囼�、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫印跡試驗和放射免疫試驗等法檢測。

（三）電鏡檢查：經(jīng)過臨床觀察，發(fā)現(xiàn)取水皰液或病變腦組織制片，在電鏡下觀察病毒顆粒，陽性率為百分之五十，但HSV與其他軟下疳病毒在形態(tài)上難以區(qū)分。免疫電鏡檢查較為特異。

（四）細胞培養(yǎng)法：通常，這種檢查方法從水皰底部取材做組織培養(yǎng)分離病毒，為目前最敏感、最特異的檢查方法，需時5天-10天。因其技術(shù)條件要求高，價格昂貴，目前尚不能普遍使用。

（五）基因檢測法：用PCR熒光定量法檢測皮損的HSV-2-DNA。能直接檢測出生殖器潰瘍性疾病患者損害部位的HSV-2病原體，敏感性和特異性高，大大提高生殖器潰瘍病人中HSV確診的能力。其費用較昂貴，且操作技術(shù)、實驗室條件和設(shè)備的要求也較高。